Izoliramo klon
Na splošno kloniranje izvajamo tako, da dobimo klon enega določenega gena ali DNK zaporedja, ki nas zanima. Naslednji korak po kloniranju je torej iskanje in izoliranje tega klona med drugimi člani knjižnice. Če knjižnica obsega celoten genom organizma, bo nekje znotraj te knjižnice želeni klon. Obstaja več načinov, kako ga najti, odvisno od posameznega gena. Najpogosteje se kot sonda uporablja klonirani segment DNK, ki pokaže homologijo iskanemu genu. Če je na primer klonirani mišji gen že kloniran, ga lahko uporabimo za iskanje enakovrednega človeškega klona iz človeške genomske knjižnice. Kolonije bakterij, ki sestavljajo knjižnico, gojijo v zbirki petrijevih jedi. Nato se po površini vsake plošče položi porozna membrana in celice se oprimejo na membrano. Celice se porušijo in DNK se loči v posamezne niti - vse na membrani. Sonda je ločena tudi v enojne niti in označena, pogosto z radioaktivnim fosforjem. Nato se za kopanje membrane uporabi raztopina radioaktivne sonde. Enoverižna sonda DNA se bo lepila na DNK klona, ki vsebuje enakovreden gen. Membrana se posuši in položi na list folije, občutljive na sevanje, in nekje na filmih se bo pojavila črna pika, ki naznanja prisotnost in lokacijo želenega klona. Klon lahko nato najdete iz originalnih Petrijevih jedi.
genetika: tehnologija rekombinantne DNA in verižna reakcija polimeraze
Tehnični napredek je imel pomembno vlogo pri napredku genetskega razumevanja. Leta 1970 je ameriški mikrobiolog Daniel Nathans
Sekvenciranje DNK
Ko je kloniran del DNK, je mogoče določiti njegovo nukleotidno zaporedje. Nukleotidno zaporedje je najbolj temeljna stopnja poznavanja gena ali genoma. Načrt vsebuje navodila za gradnjo organizma in brez pridobitve teh informacij ne bi bilo mogoče razumeti genetske funkcije ali evolucije.
Uporaba
Poznavanje zaporedja segmenta DNK ima veliko uporab in sledi nekaj primerov. Najprej ga lahko uporabimo za iskanje genov, segmentov DNK, ki kodirajo določen protein ali fenotip. Če je bilo območje DNA sekvencirano, ga je mogoče pregledati glede na značilnosti genov. Na primer, odprti bralni okviri (ORF) - dolge sekvence, ki se začnejo z začetnim kodonom (tri sosednja nukleotida; zaporedje kodona narekuje nastajanje aminokislin) in jih prekinejo neprekinjeni kodoni (razen enega ob njihovem zaključku) - predlagajte a območje, ki kodira beljakovine. Tudi človeški geni običajno sosedijo s tako imenovanimi otoki CpG - grozdi citozina in gvanina, dveh nukleotidov, ki sestavljajo DNK. Če je znano, da je gen z znanim fenotipom (kot je bolezenski gen pri ljudeh) v kromosomskem območju, zaporedoma, bodo nepriznačeni geni v regiji postali kandidati za to funkcijo. Drugič, homologna zaporedja DNK različnih organizmov je mogoče primerjati, da se oblikujejo evolucijski odnosi med in med vrstami in med njimi. Tretjič, zaporedje genov je mogoče pregledati za funkcionalna področja. Za določitev funkcije gena lahko določimo različne domene, ki so skupne beljakovinam s podobno funkcijo. Na primer, nekatere aminokislinske sekvence v genu se vedno nahajajo v proteinih, ki obsegajo celično membrano; taki raztezki aminokislin se imenujejo transmembranske domene. Če se v genu neznane funkcije nahaja transmembranska domena, to kaže, da se kodirani protein nahaja v celični membrani. Za druge domene so značilni proteini, ki vežejo DNA. Vsaka zainteresirana oseba lahko za analizo na voljo več javnih baz DNK zaporedij.
